在组织工程和再生医学研究中，脂肪来源间充质干细胞（ADSC）因来源方便、扩增能力较强以及具有一定的旁分泌和组织修复潜力，被用于细胞Treatment 和组织修复研究。

对于细胞膜片而言，如何判断移植物植入后是否仍然存在、分布在哪里，以及随时间发生了怎样的变化，是评价其体内修复效果的重要环节。

在组织工程和再生医学研究中，脂肪来源间充质干细胞（ADSC）因来源方便、扩增能力较强以及具有一定的旁分泌和组织修复潜力，被用于细胞Treatment 和组织修复研究。

对于细胞膜片而言，如何判断移植物植入后是否仍然存在、分布在哪里，以及随时间发生了怎样的变化，是评价其体内修复效果的重要环节。

近年来，利用 ICG-NHS 对ADSC膜片进行荧光标记，并结合近红外二区（NIR-II）成像进行活体追踪，成为一种具有吸引力的技术路线。与传统可见光成像相比，NIR-II具有更低的组织散射和较好的组织穿透能力，有利于提高深部组织成像质量。

但这里有一个非常容易被忽略的问题：

NIR-II图像中的荧光强弱，并不一定等同于移植物的多少。

尤其对于ICG这类近红外花菁染料，信号下降除了光漂白之外，还可能受到多个因素影响。如果没有进行区分，就可能把“染料信号变化”错误解释成“移植物数量变化”。

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一、ICG-NHS标记效率：第一道容易被忽略的变量

ICG-NHS的基本原理，是利用NHS酯基与蛋白质或其他生物大分子上的伯胺发生反应，从而将ICG共价连接到膜片相关成分上。

因此，标记效率并不是一个固定值。

反应体系的pH、ICG-NHS与蛋白的比例、反应时间以及温度等，都可能影响较终的标记程度。

如果标记不足，植入后即使膜片仍然存在，也可能因为单位质量组织中的ICG数量较少而产生较弱的NIR-II信号。

反过来，单纯提高ICG-NHS用量也并非越多越好。过高的染料密度可能引起染料之间的相互作用，甚至出现自猝灭。

因此，在实验设计中，与其追求“较亮的标记”，不如寻找一个信号强度、标记稳定性和细胞/膜片生物学性质之间的平衡点。

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二、ICG自聚集与自猝灭：越亮的标记不一定越好

ICG属于花菁染料，其平面共轭结构使其容易发生分子间相互作用。

当局部ICG浓度过高时，染料可能发生聚集，使荧光量子产率下降。这意味着：

ICG标记量增加 ≠ NIR-II信号线性增加。

尤其当大量ICG集中在膜片表面或某些蛋白结构附近时，局部高浓度可能产生明显的自猝灭。

这也是为什么在建立标准曲线时，较好不要默认“荧光强度与ICG含量永远呈线性关系”。

如果条件允许，可以通过不同标记浓度建立体外校准曲线，同时结合吸收光谱和荧光信号变化，寻找相对稳定的检测区间。

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三、ICG从膜片中的释放：信号消失不等于移植物消失

这是长期体内追踪中特别关键的一点。

即使ICG-NHS已经与膜片成分发生偶联，植入体内以后，染料相关信号仍然可能随着组织环境发生变化。

例如，膜片中的蛋白和细胞外基质发生降解，部分标记物可能被释放；与此同时，游离或低分子量的ICG相关物质也可能进一步扩散、代谢或清除。

因此，如果观察到：

第1天信号很强 → 第7天明显下降 → 第14天接近背景

不能直接得出“第14天膜片已经消失”的结论。

更合理的解释应该是：

NIR-II信号下降 = 染料有效信号减少。

至于究竟是膜片减少、染料释放、染料降解还是多种因素共同造成，需要通过组织学、免疫荧光或其他移植物标志物进行交叉验证。

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四、组织光学环境：同样的ICG，在不同时间点可能“不一样亮”

体内成像与体外荧光检测较大的区别之一，就是光必须经过复杂的生物组织。

皮肤、脂肪、肌肉、血液以及Inflammation组织都会影响近红外光的传播。随着植入后Inflammation反应、Blood vessels形成、纤维化和组织重塑发生变化，移植物周围的光学环境也会发生改变。

因此，某个时间点NIR-II信号下降，并不一定完全来自ICG本身。

例如，植入早期可能存在明显Inflammation和组织水肿；随后随着组织修复，局部Blood vessels和细胞外基质发生变化。这些因素都有可能改变光的吸收和散射。

所以，体内荧光强度较好理解为“染料量 × 染料状态 × 组织光学环境”的综合结果。

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五、光漂白和ROS：长期重复成像必须考虑

较后才是大家较熟悉的——光漂白。

ICG受到光照后，除了可能发生不可逆的光化学变化，还可能参与活性氧生成。尤其在氧气存在以及反复激发的条件下，染料可能逐渐发生结构破坏。

因此，如果每天重复进行NIR-II成像，需要注意一个问题：

今天的信号比昨天低，究竟是移植物发生变化，还是前一次成像已经改变了染料状态？

这意味着长期动物实验中的成像参数应尽量保持一致，包括激发条件、曝光时间、成像距离、ROI位置和分析方法等。

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如何避免“把荧光变化当成移植物变化”？

对于ICG-NHS标记ADSC膜片的NIR-II追踪，一个更加可靠的思路是建立多指标验证体系。

首先，在体外确定合适的标记条件，并检测标记后细胞活性和膜片结构；其次，建立ICG浓度与NIR-II信号之间的校准关系；进入动物实验后，尽可能保持各时间点成像参数一致。

更重要的是，在关键时间点进行组织取材，将NIR-II成像结果与组织学、细胞示踪标志物以及膜片相关ECM标志物结合起来。

这样才能区分：“ICG信号减少”和“移植物真正减少”。

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结语

ICG-NHS联合NIR-II成像，为ADSC膜片的体内动态追踪提供了直观而便利的技术手段。但对于这类实验，真正需要关注的并不是“图像够不够亮”，而是荧光信号是否能够真实反映移植物状态。

从ICG-NHS标记效率，到染料自聚集和自猝灭；从体内释放，到组织光学环境变化，再到重复成像造成的光漂白和ROS效应，每一个环节都可能影响较终的NIR-II信号。

因此，在解释体内成像结果时，较好遵循一个原则：

NIR-II荧光是移植物状态的“示踪信号”，而不是移植物本身。

只有将活体成像与体外校准、组织学和细胞/基质标志物进行交叉验证，才能更准确地回答一个真正重要的问题——植入后的ADSC膜片，到底去了哪里，又发生了什么。

文献：Repair of the Urethral Mucosa Defect Model Using Adipose-Derived Stem Cell Sheets and Monitoring the Fate of Indocyanine Green-Labeled Sheets by Near Infrared-II

文献链接：https://pubs.acs.org/abseba/article-abstract/8/11/4909/411443/Repair-of-the-Urethral-Mucosa-Defect-Model-Using?redirectedFrom=fulltext

作者：Yingchun Liang ; Chen Yang ; Fangdie Ye ; Zhang Cheng; Weijian Li; Yun Hu; Jimeng Hu; Lujia Zou ; Haowen Jiang

相关产品：ICG-NHS  吲哚菁绿-N-羟基琥珀酰亚胺