文献：Repair of the Urethral Mucosa Defect Model Using Adipose-Derived Stem Cell Sheets and Monitoring the Fate of Indocyanine Green-Labeled Sheets by Near Infrared-II

文献链接：https://pubs.acs.org/abseba/article-abstract/8/11/4909/411443/Repair-of-the-Urethral-Mucosa-Defect-Model-Using?redirectedFrom=fulltext

作者：Yingchun Liang ; Chen Yang ; Fangdie Ye ; Zhang Cheng; Weijian Li; Yun Hu; Jimeng Hu; Lujia Zou ; Haowen Jiang

相关产品：ICG-NHS  吲哚菁绿-N-羟基琥珀酰亚胺

原文摘要：Treatment of urethral mucosa defects is a major challenge in urology. Synthetic materials or autologous mucosa does not provide satisfactory treatment options for long-term or large urethral mucosa defects. In response to this problem, we used autologous adipose-derived stem cells (ADSCs) to synthesize cell sheets in vitro for repairing urethral mucosa defect models. In order to monitor the localization and distribution of cell sheets in vivo, cells and sheets were labeled with indocyanine green (ICG) and the second near-infrared (NIR-II) fluorescence imaging was performed. ICG-based NIR-II imaging can successfully track ADSCs and sheets in vivo up to 8 W. Then, rabbit urethral mucosa defect models were repaired with ICG-ADSCs sheets. At 3 months after operation, retrograde urethrography showed that ADSC sheets could effectively repair urethral mucosa defect and restore urethral patency. Histological analysis showed that in ADSC sheet groups, continuous epithelial cells covered the urethra at the transplantation site, and a large number of vascular endothelial cells could also be seen. In the cell-free sheet group, there was no continuous epithelial cell coverage at the repair site of the urethra, and the expression of pro-inflammatory factor TNF-α was increased. It shows that the extracellular matrix alone without cells is not suitable for repairing urethral defects. Surviving ADSCs in the sheets may play a key role in the repair process. This study provides a new tracing method for tissue engineering to dynamically track grafts using an NIR-II imaging system. The ADSC sheets can effectively restore the structure and function of the urethra. It provides a new option for the repair of urethral mucosa defects.

 

在组织工程和再生医学研究中，脂肪来源间充质干细胞（ADSC）因来源方便、扩增能力较强以及具有一定的旁分泌和组织修复潜力，被用于细胞Treatment 和组织修复研究。

对于细胞膜片而言，如何判断移植物植入后是否仍然存在、分布在哪里，以及随时间发生了怎样的变化，是评价其体内修复效果的重要环节。

近年来，利用 ICG-NHS 对ADSC膜片进行荧光标记，并结合近红外二区（NIR-II）成像进行活体追踪，成为一种具有吸引力的技术路线。与传统可见光成像相比，NIR-II具有更低的组织散射和较好的组织穿透能力，有利于提高深部组织成像质量。

但这里有一个非常容易被忽略的问题：

NIR-II图像中的荧光强弱，并不一定等同于移植物的多少。

尤其对于ICG这类近红外花菁染料，信号下降除了光漂白之外，还可能受到多个因素影响。如果没有进行区分，就可能把“染料信号变化”错误解释成“移植物数量变化”。

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一、ICG-NHS标记效率：第一道容易被忽略的变量

ICG-NHS的基本原理，是利用NHS酯基与蛋白质或其他生物大分子上的伯胺发生反应，从而将ICG共价连接到膜片相关成分上。

因此，标记效率并不是一个固定值。

反应体系的pH、ICG-NHS与蛋白的比例、反应时间以及温度等，都可能影响较终的标记程度。

如果标记不足，植入后即使膜片仍然存在，也可能因为单位质量组织中的ICG数量较少而产生较弱的NIR-II信号。

反过来，单纯提高ICG-NHS用量也并非越多越好。过高的染料密度可能引起染料之间的相互作用，甚至出现自猝灭。

因此，在实验设计中，与其追求“较亮的标记”，不如寻找一个信号强度、标记稳定性和细胞/膜片生物学性质之间的平衡点。

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二、ICG自聚集与自猝灭：越亮的标记不一定越好

ICG属于花菁染料，其平面共轭结构使其容易发生分子间相互作用。

当局部ICG浓度过高时，染料可能发生聚集，使荧光量子产率下降。这意味着：

ICG标记量增加 ≠ NIR-II信号线性增加。

尤其当大量ICG集中在膜片表面或某些蛋白结构附近时，局部高浓度可能产生明显的自猝灭。

这也是为什么在建立标准曲线时，较好不要默认“荧光强度与ICG含量永远呈线性关系”。

如果条件允许，可以通过不同标记浓度建立体外校准曲线，同时结合吸收光谱和荧光信号变化，寻找相对稳定的检测区间。

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三、ICG从膜片中的释放：信号消失不等于移植物消失

这是长期体内追踪中特别关键的一点。

即使ICG-NHS已经与膜片成分发生偶联，植入体内以后，染料相关信号仍然可能随着组织环境发生变化。

例如，膜片中的蛋白和细胞外基质发生降解，部分标记物可能被释放；与此同时，游离或低分子量的ICG相关物质也可能进一步扩散、代谢或清除。

因此，如果观察到：

第1天信号很强 → 第7天明显下降 → 第14天接近背景

不能直接得出“第14天膜片已经消失”的结论。

更合理的解释应该是：

NIR-II信号下降 = 染料有效信号减少。

至于究竟是膜片减少、染料释放、染料降解还是多种因素共同造成，需要通过组织学、免疫荧光或其他移植物标志物进行交叉验证。

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四、组织光学环境：同样的ICG，在不同时间点可能“不一样亮”

体内成像与体外荧光检测较大的区别之一，就是光必须经过复杂的生物组织。

皮肤、脂肪、肌肉、血液以及Inflammation组织都会影响近红外光的传播。随着植入后Inflammation反应、Blood vessels形成、纤维化和组织重塑发生变化，移植物周围的光学环境也会发生改变。

因此，某个时间点NIR-II信号下降，并不一定完全来自ICG本身。

例如，植入早期可能存在明显Inflammation和组织水肿；随后随着组织修复，局部Blood vessels和细胞外基质发生变化。这些因素都有可能改变光的吸收和散射。

所以，体内荧光强度较好理解为“染料量 × 染料状态 × 组织光学环境”的综合结果。

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五、光漂白和ROS：长期重复成像必须考虑

较后才是大家较熟悉的——光漂白。

ICG受到光照后，除了可能发生不可逆的光化学变化，还可能参与活性氧生成。尤其在氧气存在以及反复激发的条件下，染料可能逐渐发生结构破坏。

因此，如果每天重复进行NIR-II成像，需要注意一个问题：

今天的信号比昨天低，究竟是移植物发生变化，还是前一次成像已经改变了染料状态？

这意味着长期动物实验中的成像参数应尽量保持一致，包括激发条件、曝光时间、成像距离、ROI位置和分析方法等。

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如何避免“把荧光变化当成移植物变化”？

对于ICG-NHS标记ADSC膜片的NIR-II追踪，一个更加可靠的思路是建立多指标验证体系。

首先，在体外确定合适的标记条件，并检测标记后细胞活性和膜片结构；其次，建立ICG浓度与NIR-II信号之间的校准关系；进入动物实验后，尽可能保持各时间点成像参数一致。

更重要的是，在关键时间点进行组织取材，将NIR-II成像结果与组织学、细胞示踪标志物以及膜片相关ECM标志物结合起来。

这样才能区分：

“ICG信号减少”

和

“移植物真正减少”。

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结语

ICG-NHS联合NIR-II成像，为ADSC膜片的体内动态追踪提供了直观而便利的技术手段。但对于这类实验，真正需要关注的并不是“图像够不够亮”，而是荧光信号是否能够真实反映移植物状态。

从ICG-NHS标记效率，到染料自聚集和自猝灭；从体内释放，到组织光学环境变化，再到重复成像造成的光漂白和ROS效应，每一个环节都可能影响较终的NIR-II信号。

因此，在解释体内成像结果时，较好遵循一个原则：

NIR-II荧光是移植物状态的“示踪信号”，而不是移植物本身。

只有将活体成像与体外校准、组织学和细胞/基质标志物进行交叉验证，才能更准确地回答一个真正重要的问题——植入后的ADSC膜片，到底去了哪里，又发生了什么。